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BDTM
Free Flow Electrophoresis (FFE) 游離流式電泳蛋白質體分析儀 BDTM FFE游離流式電泳系統是BD公司研製的，是無固相基質(Solid phase)的游離流式電泳系統。它爲蛋白質體研究提供了高通量、高再現性、高靈敏度和操作簡便的解決方案。其高靈敏度和高準確性使得對標的蛋白的分離比以往任何方法都更爲有效，配備96孔收集裝置和連續分離方案使得對低濃度目標蛋白的處理同樣擁有高回收率，而非傳統變性電泳條件，使得純化後的功能蛋白更易保持活性。台灣轉錄公司是FFE的專案代理商(07-5542589)。 電泳在無電泳膠的一種薄層液相基質中進行。樣品通過蠕動泵注入分離槽，分離槽由兩個平行的特製平板構成，槽體高0.5
mm。層流驅動樣品在分離槽中運動，帶電粒子（蛋白質、細胞器、膜類、或完整的細胞等）在分離緩衝液中，由垂直於液體流方向的高電壓驅動，流動方向發生偏斜而被分離。根據等電點、分子量大小、分子形狀等泳動能力不同，樣品被分離成96個質體，收集到96孔收集器中。 産品特點 操作模式
産品應用
BDTM
Free Flow Electrophoresis (FFE) Q&A Q：
ProMetHEUS FFE是什麽？ A： ProMetHEUS FFE是FFE Weber公司的第一個用於蛋白或細胞樣品分級分離和萃取的産品，可以分離簡單或複雜蛋白樣品，與蛋白質體學研究的所有後續分離技術應用相容。 Q： 什麽是FFE？ A： FFE是游離流式電泳（Free
Flow Electrophoresis）的首字母縮寫。意即電泳是在一個薄層液相基質中進行，而沒有任何如凝膠的固定基質。 Q：
FFE能夠分離哪些樣品？ A：
FFE能夠分離各種帶電樣品，特別是蛋白、蛋白複合體、膜、細胞器或完整的細胞。 Q：
FFE分離是利用樣品的什麽物理化學特性？ A：
這取決於所採用的分離模式。可以是等電點、靜電荷密度（電荷、大小和形狀）或電泳淌度等。 Q：
同基於凝膠的分離相比，FFE的主要優勢是什麽？ A：
1）FFE是一種液態的樣品分離/製備技術，即如同所有後續分離技術（如2-DE或LC-MS） 相容。2）分離非常快。3）液相分離保證原樣品具非常高的回收率。 Q：
FFE典型的應用領域是樣品的連續分離，這是什麽意思？ A： “傳統的”分離技術，如層析法或凝膠電泳都是一種分批模式，即一次上樣操作後緊接著一個分離步驟，這稱之爲運行一次。FFE則是採用一種連續模式，即上樣和分離連續同時進行。所以對於FFE，“運行一次”實際上並不恰當，因爲一旦達到穩定狀態，分級分離過的樣品可以依照使用者的需要隨時收集。 Q：
“操作一次”需要多大的蛋白濃度？ A： 對於一個標準的實驗而言，適當的濃度範圍大約爲1～5 mg/ml不等，我們推薦開始時採用大約1～2mg/ml的濃度。FFE系統是針對製備和半製備級應用而設計的，但是採用特殊的實驗方法，在分析模式下能夠處理濃度低至50 μg/m的樣品。 Q：
“運行一次”需要多長上樣時間？ A： 標準的實驗從約5 min開始。對於連續過程而言，要定義一個上限比較困難。我們建議一開始上樣時間至少爲30 min～1 h。 Q：
“操作一次”所需的上樣速度爲多少？ A：
1～10 ml/h爲宜。 Q：
最小原樣品體積爲多少？ A： 假設上樣速度爲1 ml/h，上樣時間爲最小值5 min，則理論上的最小上樣體積爲80～100
μl。如果採用特殊的分離方法，可以達到更小的上樣體積。 Q：
“操作一次”需要的最小蛋白量爲多少？ A： 假設上樣速度爲1 ml/h，上樣時間爲5 min，上樣濃度爲最小值100 μg/ml，則所需最小蛋白量約爲8 μg。然而，需要注意的是，ProMetHEUS FFE是一種半製備型技術，而不是分析型的技術。 Q：
每小時的樣品産量爲多少？ A： 基於上述，理論上的産量爲0.1～200 mg/h。但是對於單個過程，根據樣品不同，實際上限應爲大約50
mg/h。 Q：
在完成“操作一次”之後，最小分級收集體積爲多少？ A： 假設在約5 min內注入100 μl樣品，爲了達到適當的回收率，可能需要收集10
min。分離緩衝液的流速一般爲60～100 ml/h（即每小時每單位約1
ml；亦即每10 min每單位170 μl）。如果採用特殊的分離方式，更小的收集體積也是可能的。 Q：
最大收集體積爲多少？ A：
最大收集體積僅受限於樣品量。系統以連續流方式運作，可根據用戶需要連續收集。 Q：
分離標的用什麽來收集？ A： 可用的標的分級分離收集容器有：標準96孔MTP（300
μl/孔），三種96孔deep block MTP（1、2或4
ml/孔）或Greiner微管系統（1.4 ml/孔）。 Q：
ProMetHEUSFFE使用兩性電解質嗎？ A： 我們建議使用專用的ProLytes是專利的低分子量有機酸和鹼。這些分子的性質都已非常清楚（分子量、等電點、純度、毒性），並且和標準MS相容。相比而言，Ampholytes則是由性質不明的聚合物所形成的混合物。此外，ProLytes的緩衝能力要比標準兩性電解質混合物強很多，這使得可以在更高的鹽濃度條件下進行FFE分離，而不會干擾分離效果。 Q：
怎樣除去ProLytes A： ProLytes是低分子量的有機分子，其不會干擾MS分析。如果需要從組分當中除掉，我們推薦使用Vivaspin®（Vivascience）管進行超濾。 Q：
在“運行一次”IEF-FFE（等電聚焦模式）之後，如何清除清潔劑/添加劑？ A： 可以使用超濾或反相材料去除添加劑或清潔劑。清除策略根據清除目的不同，即使是減少添加劑，也可以完全去除掉。 Q：
IEF-FFE分離的pH範圍是多大？ A：
第一個標準方法使用的是pH 3～12的ProLytes 混合物。其他pH分離範圍也將陸續適用。 Q：
可以在變性和非變性條件下運行嗎？ A： 可以。只需選擇適當的去垢劑以滿足不同的可溶性需要即可。 Q：
那些清洗劑和FFE-IEF是相容的？ A：
用於標準IEF實驗的所有商品化試劑，如Triton X-100、NP-40、ASB-14、Zwittergent®
3-10、 CHAPS、DTT等均與FFE相容。其濃度須針對每次應用進行優化，最初一般都使用0.1%的濃度。 Q：
IEF模式中，分級分離的解析度是多少？ A：
對於標準方案是<= 0.1 pI，對於特殊操作模式是<= 0.03 pI。 Q：
運行ProMetHEUS FFE最終會得到多少個組分子？ A： 系統連續流動並在一個96孔MTP中收集所有的標的。然而，爲了保證分離的穩定和再現性，含有樣品的組分數被限制到約70個。 Q：
可以改變收集的組分數嗎？ A： 可以。減少分離區域的“淨”寬度是可行的，即通過選用合適的緩衝液，含有樣品的組分數可以減少到13-70之間的任一數目。 Q：
運行FFE-IEF之後，蛋白會出現在多少個組分當中？ A： 分級分離後的蛋白一般會限制在2個甚至1個孔當中，但是這依賴于蛋白分子間相互作用的傾向和蛋白的滴定曲線圖，即蛋白在等電點附近的遷移速度。 Q：
ProMetHEUS FFE同ICAT 技術、LC-MS或2D-LC/MS/MS相容嗎？ A： 是的。ProMetHEUS FFE是一種分離和富集技術。分離組分隨後能被去除（即去垢劑、鹽等），爲進一步的分析技術做準備。對於LC-MS，樣品可以在FFE之後直接應用。 Q：
“運行一次”需要多長時間？ A： 討論“運行一次”所需時間對FFE來說並沒有意義，因爲FFE是一個連續的技術，這意味著“運行一次”的時間可以任由用戶需要而變化。因此，討論停留時間（即樣品在分離室花費的時間）更合適些。標準方案的停留時間大約爲15～20 min，即從上樣到樣品組分收集的整個時間大約爲20～30 min。基於分離室體積和分離緩衝液流速，可以很容易地計算出確切的時間。此外，內部標記（如染料SPADNS和/或彩色的pI
marker）可使整個分離過程顯示出來。如果採用特殊的分離方案，停留時間有可能減少至5 min。 Q：
FFE能夠用於哪些分離模式？ A： 標準方案爲蛋白樣品在變性和非變性條件下的FFE-IEF（pH 3～12）模式。此外，系統還能夠以PZE（製備型區帶電泳）和ITP（等速電泳）模式運行。 Q：
分離室的尺寸多大？ A： 室體有0.5 mm厚，100 mm寬和500 mm長。然而，分離區域的“淨”寬度能夠在13～70
mm之間變化。 Q：
FFE會稀釋樣品嗎？ A：
是的。請參考下一個問題瞭解細節。 Q：
採用下面給出的參數，樣品會稀釋100倍嗎？ 樣品濃度 100 μg/ml 上樣速度 1 ml/h 分離緩衝液流速 100 ml/h = ～1 ml/h/孔（96孔板 運行時間 1h A： 是的。如果收集併合並所有組分，樣品將稀釋100倍。假設上樣速度爲1 ml/h，分離緩衝液流速爲100 ml/h（對96孔板而言是～1 ml/h/孔），樣品中的一種蛋白分佈在2～3個組分當中，則最終每個蛋白會稀釋2-3倍。這不依賴樣品中的蛋白數目。只要上樣時間（如樣品體積）足夠高/快，樣品的初始量就與稀釋無關。然而，回收還限於吸附現象。爲了達到適當的回收率，整個樣品收集時間應當比整個上樣時間略長（5～10 min）。因爲分離室中間的蛋白和靠近室壁流動的蛋白需要的時間不同。這轉變成一些額外的稀釋。 Q：
“運行一次”之後，蛋白的回收率能夠達到多少？ A： 同其他技術相比，FFE內室和分級分離出口的表面積相對更小。此外，通過使用合適的表面材料和添加劑，材料的吸附現象也減少了。因此，如果運行時間和樣品量不是很低，那麽對於大多數樣品而言，回收率會接近100%。 Q：
FFE運行當中，樣品會沈澱嗎？ A： 同其他技術相比，沈澱非常少，因爲所有分離都是在使用適當的分離緩衝液的液相中進行的，而不依賴固體基質（如膜或凝膠）。如果沈澱發生了，可以通過分離室透明的前板清楚地觀察到。分離條件就可以容易地進行優化以抑制沈澱發生。 Q：
尿素會在收集管裏沈澱或結晶嗎？ A：
只要遵循方案操作就不會。如果緩衝液流速或分離室溫度太低，有時也會發生。 Q：緩衝液是否會使蛋白完全溶解，特別是膜蛋白？ A：由於膜蛋白具有強疏水性，確實不容易溶解。FFE不僅可以在非變性條件下分離蛋白，也可以在變性條件下分離蛋白。選擇合適的去垢劑和緩衝液，可以實現膜蛋白的完全溶解。 Q：膜蛋白在等電點周圍容易沈澱，FFE如何有效避免？ A：可以不選擇IEF模式，在ITP模式下分離膜蛋白。 Q：
分離液使用的是什麽緩衝液？ A：
按照標準方案，只含有甘油、HPMC（也可無）、尿素、硫脲和Prolytes。 Q：
ProMetHEUS FFE使用的樣品緩衝液成分？ A：
所有具有相似密度/粘度/導電率的緩衝液同ProMetHEUS FFE都是相容的，即可將樣品 溶解在分離緩衝液中，或者用分離緩衝液將樣品進行稀釋。 Q：
怎樣知道何時開始收集組分以減少稀釋？只能通過計算嗎？有沒有可見的染料？ A： 樣品可以和紅色染料“SPADNS”混合。一旦觀察到收集點出現了紅色液滴，就可以開始收集樣品了！FFE Weber公司提供這種染料。 Q：
怎樣知道FFE系統是否正確運轉？ A： FFE Weber公司提供了一組有色的pI
marker，能夠用來控制FFE-IEF分離的質量。我們還提供一個包含性能測試的標準操作程式(SOP)。對於ProMetHEUS enhanced FFE系統，使用者可以儲存“操作標準參考”，以同實際分離效果進行比較。 Q：
關閉FFE系統需要多長時間？ A： 一天結束或是一次實驗結束以後，需要用持續流動的分離緩衝液和純水沖洗整個系統20 min。隨後，充滿純水進行過夜漂洗。 Q：
清洗FFE系統需要多長時間？ A：
打開分離室，用水、異丙醇和石油醚手工沖洗。會花費大約10-15 min。 Q：FFE的重復性如何？運行幾次，同樣的樣品是否會被收集到同一管中？
Q：複雜蛋白是否會影響緩衝液的pH值，偏差是多少？ 有同樣的濃度、粘度和導電性。 Q：FFE爲什麽具有3個進樣口？ A：爲了得到最好的解析度。不同樣品在分離條件下所帶電荷不同。如果樣品帶負電荷，在接近陰極的進樣口進樣，樣品向陽極移動需要較長的遷移，從而得到較好的解析度。反之亦然。 Q：持續上樣時間是否可以超過2～3周？影響因素是什麽？
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